曾经我用 rMATS进行可变剪切分析，现在我觉得 IsoformSwitchAnalyzeR更香。

IsoformSwitchAnalyzeR功能总结如下。

注：

总而言之 IsoformSwitchAnalyzeR不仅仅是分析可变剪切事件，还整合了蛋白结构等信息用于判定可变剪切是否影响蛋白功能，同时包含了基因组整体的分析。

本文用 RNA-seq数据过一遍 IsoformSwitchAnalyzeR分析流程。输入数据是 Salmon定量结果，不知道 Salmon如何用的同学赶紧去看《Salmon进行转录本定量》。

用 BiocManager安装。

导入 Salmon定量数据。Salmon每个样本结果在单独目录，这里 parentDir是这些目录的上级目录，能包含所有结果。

导入后会被保存到列表对象。包含每个转录本的 read counts和丰度 TxPM以及有效长度等信息。

用 importRdata函数整合所有需要的信息，包括表达数据、实验设计(Design Matrix)、注释信息等。

这里 isoformNtFasta是每个转录本的 fasta序列文件，在 Salmon建立索引时也要用到。完成后返回 switchAnalyzeRlist对象。

进行过滤，减少下游分析计算量。

分析差异表达的 isoform(差异可变剪切分析)。

这里 alpha是调整后 P值阈值。

ORF分析和取得序列，包括将 ORF序列翻译到氨基酸。

文件将被输出到 pathToOutput指定目录，输出的文件可以供 CPAT, Pfam, SignalP等分析。这些软件的分析结果，接下来整合到 switchAnalyzeRlist对象里。

注：到这里就用输出的序列文件自行做 CPAT, Pfam, SignalP分析，取得这些分析结果后再往下继续可变剪切分析。当然你也可以不做这些分析或只做部分，我这里做了 CPAT和 Pfam没做 SignalP分析。

进行可变剪切分析。

这里 consequencesToAnalyze根据已经整合的注释数据进行选择，我这里整合了 CPAT结果就可以加入 coding_potential分析。没有整合 SignalP结果，就不能进行 signal_peptide_identified分析。

输出可变剪切结果图, n是数目 Inf代表输出所有结果。

输出所有的可变剪切事件后，可以查看自己感兴趣的基因/事件。下面是我这次结果的几个图。从图中可以查看每个 isoform结构以及被样本使用情况以及组间是否显著差异。

下面的函数可以查看基因组总体的可变剪切分析。

SplicingSummary图示例：

第二个图画的是 prop.test函数结果。表明 gain/loss占比是否显著的改变。0.5表示占比没有改变。

各简写含义：

[参考]

IsoformSwitchAnalyzeR.utf8